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蜂毒肽，含有26个氨基酸的小蛋白残留，是蜂毒的主要毒性成分。它是水溶性的作为一个四聚体，但它自发集成到脂质双层，被认为是作为一个溶解剂。我们在这里描述三维蜂毒肽的结构体经X射线衍射分析在2A分辨率晶体结构分析。结构—真实的讨论中的相互作用四个多肽链，并与NMR和其他光盘实验。
每个蜂毒肽链由两个凹陷—其整体形状为弯杆。这个氨基末端20个残基排列不对称关于弯曲杆根据其极性。十每个链中的大极性残基的一侧弯曲的杆，和对面的脸包含四极侧链，四个小的非极性侧链和脯氨酰残留.链的C-末端6个残基完全极。
在四四链堆积在一起具有近乎完美的222对称性认为室内是几乎完全由非极性侧链和表面极性—
会费。在与蜂毒素亚基的接触四聚体几乎都是疏水的，已螺旋线交叉分析。平衡之间的疏水性粘附的单体和24个正电荷的静电斥力在四收费是这样的：蜂毒是四—美国在毒囊当时的浓度蜜蜂和单体的最低浓度细胞溶解所需。折叠的可能途径蜂毒素的单体为四提出，是部分是基于NMR研究别人。
蜂毒肽是蜂毒的主要有毒成分蜜蜂，Apis mellifera（1）。虽然它是水溶性的作为一个单体或四聚体（2,3），该多肽容易融入和破坏天然的和合成的磷—磷脂双分子层（4-15）。可能是由于这个膜中断，蜂毒磷脂酶A2活性增强（16，17），在众多影响活细胞（18-25）。
由美国国家科学基金会资助的PCM 80-03725支持和美国公共卫生服务格兰特通用16925。成本发表这篇文章的部分是由支付版面费。本文必须特此注明“aduer—tisernent”根据18 U.S.C. 1734节的标示这一事实。
美国国家科学基金会研究生奖学金。0应向谁通信。反映这些特性，蜂毒肽的一级结构是两亲。第一20个残基的疏水十三—BIC只有两是带电的，而过去的六四充电，其余两个是极地。完整的蜂毒肽序列如下（26）.
NH2-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Th-Gly-Leu-Pro-
Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-GIn-Gln-CONH~
为了了解属性的结构基础蜂毒肽蜂毒肽，我们已经几个晶体形式从水溶液（27）。我们在这里讨论的结构蜂毒素在体的形式确定为I1的晶体，在前面的文件中概述（28）。可能关系—的分子和晶体结构的船舶蜂裂解和表面性质将在别处讨论（29）。
材料与方法
氢键主链酰胺氮原子—问题potentidy氢键与氧原子如果钝由酰胺氮，酰胺氢形成的角，和氧为150至180“和酰胺氮之间的距离氧小于3.5 A。
中一组蛋白质原子的密度和堆积密度为了评估包装的松紧度和计算“密度”对蜂毒肽四聚体部分，相似的过程理查兹（30）紧随其后。给定一组坐标蛋白质原子，这些原子所占据的体积被定义为水分子将无法访问的体积，如果原子团置于水中。此卷估计假设水分子有一个有效的范德瓦尔斯半径1.4 A和水分子可以占据任何位置，只要水分子的范德瓦尔斯包络不穿透任何蛋白质原子。蛋白质原子范德瓦尔斯半径
理查兹（30）建议使用，除了原子色稠环和胍基的作为单个原子的半径为1.7 A，而不是作为原子的组描述通过与类似的有效尺寸旋转椭球。
一旦被一组蛋白质原子占据的体积被阻止—定义了水中原子群的比容由于总占用体积与蛋白质质量的比值原子。该区域的“密度”被定义为比容。该区域的堆积密度被定义为的范德瓦尔斯信封内的体积的比率
蛋白质原子的总占有量。包装密度紧密堆积的球体是0.74，和紧密堆积的气缸，它是0.91。）
螺旋-螺旋交叉角对α-螺旋蛋白结构段为圆柱体；气缸轴线的位置是由一个“最小二乘”拟合的主链的N，C，和羰基C原子的表面圆柱.定义了两圆柱轴线之间的交角作为他们之间的投影平面之间的角度中间他们。
暴露的原子的溶剂原子结构被认为—如果球被1.4个半径可以被暴露于溶剂接触原子的范德瓦尔斯包络而不穿透其他原子的范德瓦尔斯包络。
对蜂毒肽的结构解释
图1。从四一蜂毒肽链构象。一、链示意图（见图2）蜂毒肽。（图Mallory Pearce。）6、立体显示链大约O trientation A.原子吸引半径等于15%的范瓦尔斯半径。
Results
多肽主链结构和氢键在四个蜂毒肽链的多肽主链具有弯曲杆的整体形状（31），约有120 ^弯角。残基形成一个螺旋结构1-10相连，通过弯曲的残基11和12，一个较长的螺旋含有残留13-26（图1）。即使在弯曲的区域，然而，在一般的多肽主链螺旋，但螺旋在肽组连接11和12的残留量，转180 ^远离预期在α-螺旋.对于链非肽组似乎是一个α-螺旋的氢键模式（见图），除非，当然，thr-10羰基氧不氢键pro-14。在链上的酰胺氮LEU-9，虽然他们在弯道的两侧。B链，对Leu-13氢键的val-8羰基氧酰胺氮。我们还注意到，因为在残基11和12弯曲的性质是螺旋的蜂毒茶两螺旋片.
空间分布为非极性和极性氨基酸侧链上的蜂毒肽螺旋虽然残基侧链的疏水性1-6所有，更非极性甚至在这一地区的其他是螺旋的一侧。原因是，ile-2，val-5笨重的侧链和leu-6均设置（图1）向“内”的一面或弯杆的“上层”的一面。而螺旋面只有小ala-4链。有一个几乎完整的非极性和极性侧链残基7-20空间分开是。大多数的非极性残基的vla-8，LEU-9，leu13，leu-16，lle-17，trp-19，和ile-20都在其内表面或外链的上表面；亲水性残基lys-7，thr-10，THR-11，和ser-18都在弯曲杆的外表面。pro-14是唯一较大的非极性侧链，在弯曲杆的外表面。
链中的最后六个残基都是亲水性的；四个带正电荷的赖氨酸和精氨酸侧链几乎直接脱离了螺旋的骨架，使它们很好地分离，并且整个螺旋的圆周在这个区域被充电。.
蜂毒肽链可以分为三个区域，根据极性和非极性侧链的分布；1）疏水氨基端区域，2）具有疏水性和亲水性的脸的中央部分，和3）一个完全亲水性的C-端区域。
对称的teramer在四四蜂毒肽链几乎identicla构象。两链（链的不对称单元中的A和B图2）是由一个近似的2倍的轴线对称关系。这些链运行平行与他们的“上”面（图1）密切接触。对称性的精确的2倍的轴线，垂直于近似关系链，A和B在四其他两链（链C和C图。2），将所有的内表面.
亚基接触在四蜂毒内基本上所有的亚基接触的蜂毒肽四聚体的疏水性。似乎没有氢链和最近的电荷之间的相互作用，结合赖氨酸23链和23链的赖氨酸C和B和D这对原子之间的距离似乎在4-6之间，虽然这是不确定的因为我们多isomorphour置换图的侧链残基21-26地点不明确尚未完全解决。（28）图。2.cut-away图显示在四蜂毒肽链的包装。链A是我们电子中的链
密度图（见前纸，参考文献28）。链B与链A有关，由近似2倍的轴大致垂直于该页。
链C和D有关链A和B由确切的2倍轴几乎在平面的页面表示。（图由Mallory
皮尔斯.J
如图2所示，疏水残基上的“内”和“每个蜂毒肽链上“表面都用四聚体的内部，这是完全非极性。在这个区域，40缬氨酰侧链，亮氨酰，异亮氨酰，AE包装非常紧密和色氨残基从单独的链和氨基酸残基高叉（图3A）。
由于每个蜂毒肽链主要是α-螺旋，亚基在四聚体亚基的接触可以被描述的螺旋-螺旋接触。有四种不同类型的关闭在蜂毒肽四聚体螺旋接触。由于对称—的四聚体法仅为222左右，并不是所有的一种特殊类型的螺旋交叉的例子是iDEN—切。图4显示的交叉角度和插层在每个类型的一个例子中的侧链。可以看出在每一种情况下，所有的下部螺旋的侧链（图4所示的固体补丁）位于侧面之间上螺旋链（以开放补丁表示）。
蜂毒肽溶剂间的相互作用，而内部联系在四蜂毒肽几乎完全apolarresidues之间，蜂毒肽与溶剂的相互作用涉及到一些非极性基本上所有的极性残基。几乎所有的水电—亲水侧链是至少部分暴露于溶剂的
“材料与方法”下的判据。E—这四lysines-23氨基是不可访问的溶剂在我们的模型，但这些侧链的位置是相当不确定（28）
高电荷的C-末端的四链的间距除了，除了四lys-23侧链，所有邻近链上的电荷至少是7。阿迪—
上，为lys-7，thr-10，THR-11的侧链，和ser-18残留所有点直接进入溶剂。耦合随着四聚体的对称性，其结果是极这个侧链形成一个亲水的“外衣”在四（图2）。在亲水侧的192个非氢原子在四聚体链，156暴露于溶剂。相反,形成的四聚体核心的非极性残基几乎完全屏蔽溶剂的亲水侧链和多肽主链；198个原子疏水侧链，只有66是可访问的溶剂。
蜂毒素的结构细化的过程中，我们是trp-19和邻四链ARG-24侧链—在晶体中，3.4和6之间8之间，远离总共八个独立的带电或极性基团。为探讨在以前的论文（28），这些溶剂分子的概率—巧妙的甲酸和硫酸根离子。图3B显示了一个模型这些离子附近的区域。
色氨酰侧链环境由于蜂毒肽的众多荧光研究（例如参考文献。2，9、12），的色氨酰侧链是特别感兴趣的。在这四个残基的肽四聚体与极性和非极性基团接触（图3C）。N，和在每个色氨酰侧链的一个或两个其他原子暴露于溶剂，和每个色氨酸吲哚环—phanyl残留在4-6 8，三或四的带电基团。此外，每个吲哚环是许多非极性侧链的密切联系。
在11 crystals-fig. 5四包装示意图显示一个垂直于C轴的一部分B四厚通过蜂毒肽形式I1晶体。它可以
看到这个数组四聚体是由两层二聚体夹在一起：上层其中哪双链从每个四聚体从左下到右上和一个较低的，其中链运行从左上右下。在每一层中，端到端之间的联系链是非常密切的，因为是侧到侧的接触二聚体。这些端到端二聚体形式长蜂毒素的“弦”。另一方面，链之间的侧到侧的接触不相同的四部分很遥远；最近C二聚体的字符串之间的方法是10个8，。因此，有基本上没有接触层内持有字符串端到端二聚体。然而，作为每个二聚体上层附着在下平面上的二聚体通过分子内疏水接触，整个阵列四是举行我I L Y。我也可以通过检查看到无花果。1,2和5，每一个在Fig.的两层链5是两亲性的；一层表面是亲水性的四聚物的外侧）和其他表面疏水性—BIC（四聚体的内部）。
对C方向的四聚体阵列的包装（如图5到页面垂直）是相当简单的。它们彼此垂直地堆叠在一起，除了每一个被转换为180。蜂毒肽晶体可以看作是一堆平行蛋白膜。
讨论
整体设计的四聚体-四蜂毒肽的结构似乎非常适合作高水溶性的在一个小的蛋白，具有非极性残基的优势。大部分的电荷和极性氨基酸侧链是分散在聚体的表面；随着四链的多肽骨干，这些残基形成亲水外壳屏蔽非极性侧链从溶剂中的核心。此外，由于蜂毒肽四聚体只含有正电荷间的静电斥力，天河城可能有助于蜂毒肽的水溶液中的溶解度。
聚体的疏水核心具有密度约0.74 g/cm3，类似于液体癸烷（0.73克/立方厘米，参考文献32）。四聚体作为一个整体包装密度0.80，即在四聚体80%的空间是在四原子范德瓦尔斯半径内，和1.41克/立方厘米，质量密度。理查兹（30）计算了包装密度和质量密度核糖核酸酶的以类似的方式；ovtained值分别为0.74和1.29克/立方厘米，分别。蜂毒肽的密度更大的可能是形成四螺旋杆，没有将低密度的必要性变。
螺旋线穿过拥挤的内部蜂毒肽四聚体是由八个侧在四螺旋片段。Chothia et al.。（33）有研究了双螺旋包装和发现有几个螺旋螺旋通道的模式，可以占几乎所有的密切接触之间对在十个不同的蛋白质α-螺旋结构。在这些共同的螺旋螺旋交叉模式，两个螺旋的侧链相互交错的“脊成槽”时尚。所有的四种类型螺旋的螺旋通道中发现的蜂毒肽四聚体落入这些模式之一。在图4中交叉A是一种类型3-4由2和6的残基形成的脊中的交叉（33）脊形成的较低的螺旋（链A）平行运行残基21和24在上螺旋（链B）。
交叉角33”；价值由Chothia等人建议。（33）为螺旋线螺旋距为11 A型20“。交叉B是一种3-4型“交叉脊”包装。残留12下螺旋是甘氨酸，所以残留在上面的5螺旋可以直接装在上面（33）。在这个十字路口由残基8和12形成的脊和由下部的5和9螺旋包横跨山脊形成的残留物5和8的上螺旋。在这种情况下的交叉角为45通过Chothia等人建议。（33）是- 55。C和D交叉口都是1-4型交叉口。在交叉C，形成脊由残基5和9的下螺旋平行运行这会形成残留15,16和17上，螺旋。上螺旋体残基15和17的侧链其实不穿越飞机中途两人之间4。同样，在十字路口螺旋，因此不示图。D、残基19和23的下链形成垄跑平行的残基18，19，和20的上部螺旋（但仅上螺旋的残渣19实际上与下螺旋）。交叉角为C和D交叉口110和113”；那些由Chothia等人建议。（33）-分别为109和“114”。
蜂毒肽序列的作用，我们可以想象出几种这个5赖氨酸和精氨酸残基的主要作用蜂毒肽链。首先，如上所述，+ 24收费蜂毒肽四聚体（包括可能的NH2末端）有助于防止在蜂毒肽四聚体聚合解决方案。在第二水平之间的平衡，蜂毒肽溶液中的单体和四聚体可能受到影响每个单体的六正电荷。在解决方案
是生理离子强度和pH值，四聚肽以大致相等的比例存在蜂毒肽单体当总的蜂毒肽的浓度大约是下午200点（3）。这是约100倍浓度的蜂毒肽的要求产生红细胞稀悬液50%裂解（4）并可能小于1 / 100的浓度发现工蜂的毒液囊（信息估计）（35）及（（36））。该单体的四聚体平衡问题—采用非极性的“吸引力”巧妙地确定蜂毒肽的疏水侧链与带电侧链的静电排斥。因为梅尔—ittin似乎在脂双层的是单体（11，13），这四聚体和单体之间的平衡可能比重要的生物学功能的蛋白质。最后，一旦蜂毒是绑定到一个膜含有磷脂—IDS，蜂毒肽的正电荷可能与在脂质磷酸基团，结合蜂毒肽F D Y的膜和可能影响脂质结构。Haber—Mann和Kowallek（37）准备修改蜂毒肽的氨基末端氨基酸和赖氨酸€氨基组是琥珀。这是大量的蜂毒肽—蜂毒肽上比不溶解，虽然这并不表明这是直接由负取代正电荷。
proline-14可能有助于在形成的几种方式的弯曲的蜂毒肽链虽然它实际上是部分外链的二个区。首先，由于pro-14不形成氢键thr-10，α螺旋不稳定的残基10和14之间。二、原子在脯氨酸侧链与羰基非常接近如果链条保持在一个α-螺旋的thr-10氧原构象。弯曲的形成缓解了这一关接触。需要注意的是，然而，那Degrado等人。（15）发现合成蜂毒肽模拟不含有脯氨酸在水溶液中形成一个四聚体。
在残基11和12在每个蜂毒素的弯曲的影响链是让蜂毒肽链之间的联系否则将是可能的。这可以理解注意的是，如果所有四个链是直的α-螺旋，每侧由侧对链将有一些密切接触点并会偏离那个点（34）（除非所有的链运行平行，在这种情况下，从单独的螺旋侧链不能紧密包装
共同根据模型Chothia et al.。（33）。在蜂毒肽四聚体，每对侧—侧链有两个紧密接触，因为弯曲允许螺旋在两个地方交叉。因此，所有四链在靠近，在残基1-20。
从单体到四聚体可能的折叠途径Melittin Lautenvein等人。（38）研究单体利用核磁共振方法在水溶液中的蜂毒肽和发现，虽然单体蜂毒肽主要是在一个灵活的扩展（non-a-helical）形式，残留5-9和14-20更高度结构化的比链的其余部分。他们认为，这两个疏水链段可作为单体肽折叠成核中心分为四聚体。在我们的模型检验，我们注意到，几乎所有的残留的蜂毒肽四聚体亚基接触都包含在这两个段（见图4）。每个链的蜂毒肽与另一个链联系在这两段与另一个链一个或这段的其他.
我们建议，折叠途径从单体四蜂毒可能组成的α-螺旋的形用柔性铰链在残留5-9和14-20结构残留10-13，其次是HY的接触和粘附—两平行的蜂毒肽的疏水性侧链的子如图2所示形成AB二聚体。我们希望这会发生在每个链粘附有120弯两个区域允许关闭从两个protomers包装侧链之间。折叠过程中的最后阶段，可能是两蜂毒肽二聚体或双链到一个二聚体形成的四聚体单独添加之间的接触。
与核磁共振结果的比较共振和圆二色性的NMR研究布朗等。（3）表明，ile-2侧链是密切接近四蜂毒肽色氨残基。在我们的模型中的CS，ile-2链约为3个C，色氨酸—19链B和C，在B链ile-2约4个C，在链的布朗等人trp-19。（3）也建议C—在四聚肽末端的亲水性残基国家采用越来越多的各种构象
温度从30上升到90°C，而大部分温度升高NHS的末端的20个残基，保持在一个基本futed构象。这似乎是合理的，因为有很多在疏水性残基之间的分子间的接触四残留1-20但只有几间接触残留21-26。因此，C-末端区域可以可能采用灵活的构象，而不会影响四聚体的整体包装.
晶体的结果只同意质量—定性与最近进行的CD测量四蜂毒肽。四蜂毒肽被发现是48%个—螺旋使用CD（11），而我们发现，约90%的骨干的蜂毒肽可以被描述为α-螺旋。然而这些CD测量进行在低得多的盐浓度比那些用于结晶的MEL—ittin。也许是带正电荷的羧基末端螺旋然后在低离子强度以及高温。
致谢感谢Drs. W. Wickner和S. G. Clarke的讨论。